Prinsip Dasar Isolasi Plasmid

Metode isolasi DNA dari bakteri (plasmid) ini biasanya sering kita sebut miniprep yang singkatan dari mini-preparation. Ada pula yang mengatakan medi-prep. Apakah bedanya? Mini-prep maupun medi-prep sebenarnya metode yang digunakan sama, tetapi hanya jumlah volume saja yang beda. 

Mini-prep adalah small scale isolation of plasmid, sedangkan medi-prep adalah large-scale isolation of plasmid.Prinsip dasar isolasi DNA yang ditulis di sini bersumber dari buku Molecular Cloning (karya Sambrook). Isolasi DNA, bisa dengan cara manual (seperti yang ditulis di sini) dan bisa dengan menggunakan KIT. Dengan menggunakan KIT, keuntungannya adalah akan menghabiskan waktu relatif singkat daripada metode manual, tapi akan biaya yang dikeluarkan akan lebih mahal karena buatan suatu pabrik molekuler. Tetapi pada dasarnya, semua metode baik dengan KIT atau manual bersumber dari buku Molecular Cloning.


Prinsipnya adalah pertama setelah kita kultur bakteri (biasanya menggunakan E.coli) selama semalam, kita sentrifuge yang gunanya adalah kita hanya mengambil kulturnya dan menghilangkan medium-nya. Setelahnya kita perlakukan dengan pemberian solution I, II, dan III. Solution ini semuanya adalah lysis buffer. Pada solution I kita bisa melihat komposisinya adalah glucose yang konsentrasinya tinggi. Seperti pada prinsip difusi-osmosis, jika ada larutan yang konsentrasi tinggi masuk dalam sel, dengan sendirinya membran sel akan rusak. Kemudian pemberian solution II yang harus fresh (NaOH dan SDS). Solution II ini kita menggunakan NaOH sebagai alkali, yang berfungsi merusak membran sel. Dan dalam step ini perlu kita ingat bahwa kita tidak boleh mem-vortex pada saat mix. Kalau kita vortex, semua akan hancur termasuk DNA-nya (NaOH adalah alkali kuat). solution NaOH dan SDS tidak untuk di-autoclaved maupun on ice, karena SDS sangat sensitif terhadap itu. SDS di sini adalah sabun yang juga untuk menghancurkan membran sel. Jadi bisa dilihat bahwa apabila kita membuka tutup tube (pada saat akan memasukkan solution III), ada lendir-lendir di mulut tube. Itu menandakan bahwa membran sel telah lysis.  Sedangkan solution III berguna untuk neutralization, yang di situ dapat kita liat membran-membran yang telah lysis menggumpal dan menyatu. Nah, maka dari itu kita perlu sentrifuge untuk mengendapkan membran-membran yang lysis, sehingga yang kita ambil hanya supernatan (larutan bening yang berisi DNA).
 










Setelahnya kita mendapatkan larutan bening itu, kita beri dengan PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol), yang berfungsi untuk menghilangkan komponen-komponen lain dalam sel, misalnya protein. Karena target kita adalah mendapatkan DNA murni. Dan kita pun treatment dengan ethanol 100% dan buffer NaAc (Natrium Acetat). karena DNA ini tidak larut dalam ethanol, maka dengan pemberian ethanol kita akan melihat DNA di situ. NaAc sebagai garam/buffer berfungsi untuk membantu pengendapan. Sehingga proses ini kita dapat namakan ethanol presipitasi, yaitu penggendapan DNA dengan pemberian ethanol. Selain itu untuk membantu pengendapan, kita inkubasi di -20 derajat sekitar 1 jam, kemudian setelahnya sentrifuge dan washing dengan ethanol 70%, dry up dan pemberian TE. Pada dry up ini DNA harus benar-benar bersih dari ethanol, karena jika tidak bersih dari ethanol maka DNA tidak akan mau larut.

Setelahnya kita lakukan purifikasi. Purifikasi di sini bertujuan agar kita mendapatkan DNA yang benar-benar murni, tidak terkontaminasi dengan RNA. Bisa kita lihat pada step ini kita treatment dengan pemberian RNAse, supaya RNA yang terkontaminasi bisa hilang.

Berikut adalah metode lengkapnya :
 
Isolation of plasmid :
overnite culture cell (2 ml LB)
↓
12000 rpm, 5 min, 4oC
↓
take pellet
+ 100 ul solution I *
↓
vortex
↓
+ 200 ul solution II *
↓
swirling 6-8 x
↓
on ice 5 min
↓
+ 150 ul solution III *
↓
swirling 6-8 x
↓
on ice 5 min
↓
12000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take supernatan
+ 400 ul PCI (Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol = 25 : 24 : 1)
↓
vortex
↓
12000 rpm, 5 min, 4oC
↓
take supernatant (400 ul)
+ 2.5xvolume ethanol 100% (1 ml)
+ 0.1xvolume 3M Natrium Acetate (40 ul)
↓
mixed
↓
incubate -20oC, 1 h
↓
12000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take pellet
+ 1 ml ethanol 70% cold
↓
12000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take pellet
↓
dry up
↓
+ 25 ul TE or H2O
Purification of plasmid :
DNA (25 ul)
+ 5 ul RNAse A (0.1 ug/ul)
+ 20 ul ddH2O
↓
incubate 37oC, 1 h
↓
+ (PEG : NaCl)* : DNA
3 : 5
30 ul : 50 ul
↓
incubate 30 min, on ice
↓
10000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take pellet
+ 1 ml ethanol 70% cold
↓
10000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take pellet
↓
dry up
↓
+ 20 ul TE